CÁC XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI C

Nguyễn Thanh Tòng, Phạm Thị Thu Thủy, Hồ Tấn Đạt, Nguyễn Bảo Toàn, Nguyễn Bá Tòng, Nguyễn Thị Kiều Oanh, Đỗ Thị Thùy Trang.

Viêm gan do virus viêm gan C (HCV) là một bệnh nguy hiểm, khó điều trị, hậu quả bệnh nặng nề, chưa có thuốc chủng ngừa. Chính vì vậy, việc xác định, định lượng cũng như định được type của HCV là những thông số rất cần thiết cho các bác sĩ lâm sàng để lựa chọn phương án theo dõi và điều trị bệnh nhân. Chúng tôi thực hiện các kỹ thuật miễn dịch để tìm anti HCV, định serotype HCV, kỹ thuật sinh học phân tử để xác định HCVRNA bằng PCR, định lượng virus trong máu bằng Branched DNA. Kết quả cho thấy có 70% trường hợp HCVRNA[+] trong 319 trường hợp anti HCV[+]; Serotype HCV trong 169 trường hợp chủ yếu là type 6: 44.38%, thứ hai là type 1: 37.28%, với type 1 là type khó đáp ứng trong điều trị đặc hiệu. Kết quả định lượng cho thấy lượng virus cao và rất cao cũng chủ yếu thuộc trong 2 type trên. Qua kết quả trên chúng ta thấy vai trò các xét nghiệm sinh học phân tử trong chẩn đoán và điều trị viêm gan siêu vi C.

I. Đặt vấn đề:

Viêm gan do siêu vi C (HCV) là một bệnh nguy hiểm vì triệu chứng lâm sàng thường mơ hồ, trong khi đó hậu quả của bệnh để lại thường là nặng nề như: 50%-80% chuyển qua mạn tính, và có tới 20%-25% bệnh nhân mạn tính diễn tiến qua xơ gan và ung thư gan 3,6,8,9,11,15. Do đó, chẩn đoán chính xác tác nhân HCV là một mục tiêu quan tâm hàng đầu của các bác sĩ, từ đó mới điều trị, theo dõi diễn tiến và biến chứng của bệnh, phòng ngừa sự lây lan của HCV.

Ðể chẩn đoán viêm gan do siêu vi C, ngoài các xét ngiệm đánh giá chức năng gan, siêu âm... thì các xét nghiệm tìm HCV giữ một vai trò rất quan trọng. Bên cạnh xét nghiệm anti HCV, chúng tôi đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán thường qui để xét nghiệm trực tiếp tìm HCVRNA, một bằng chứng của nhiễm HCV & virus đang tăng sinh 6,8,9. Mặt khác, điều trị đặc hiệu HCV rất tốn kém, cho nên trước khi tiến hành điều trị ta nên đánh giá khả năng điều trị thành công cao hay thấp. Hai yếu tố giữ vai trò quan trọng trong tiên lượng đáp ứng điều trị là số lựơng virus và loại (type) virus 2,6,8,9.

Mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) Khảo sát tỷ lệ HCVRNA ở bệnh nhân có anti HCV[+]; (2) Tìm hiểu mối tương quan giữa số lượng HCVRNA và type HCV; (3) Đánh giá khả năng phát triển của xét nghiệm để đáp ứng trong việc chẩn đoán và điều trị HCV.

II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:

1.Ðối tượng nghiên cứu:

Các bệnh nhân đã được chẩn đoán nhiễm HCV đến thực hiện HCVRNA tại MEDIC, từ tháng 10/1999-6/2000.

Các bệnh nhân viêm gan siêu vi C main tính , thực hiện định lượng & serotype HCV trước khi bắt đầu điều trị đặc hiệu từ tháng 10/2002 đến tháng 3 /2004.

2.Phương pháp nghiên cứu:

2.1 AntiHCV:

Kỹ thuật : miễn dịch gắn men trên vi hạt (MEIA: Microparticle Enzyme Immuno Assay).Test kit: AntiHCV, thế hệ 3 ,Abbott. Thực hiện trên máy miễn dịch tự động AXSYM, Abbott.

2.2 Định tính HCVRNA:

Kỹ thuật Heminested PCR: Khếch đại DNA đích. Ly trích RNA dựa theo qui trình Chomozynski. Ly trích RNA bằng Phenol – chroroform. Thực hiện Heminested PCR trên máy Bio-Rad, theo chu kỳ nhiệt : 40 ­­ oC/10 min; 94­­ oC/ 30 sec, 70­­ oC/30 sec, 20 chu kỳ; 94­­ oC/30 sec, 56­­ oC/30 sec, 72­­ oC/2 min, 40 chu kỳ; 72­­ oC cho 10 min. PCR mix: Enzym Reverse Transcriptase (Pharmacia), Enzym Taq polymerase (Pharmacia), dNTP (Pharmacia), Primer (Invitrogen), UNG (Pharmacia), MgCL 2, Mn CL 2. Điện di phân tích kết quả trên gel agarose, chụp hình bằng hệ thống Gel Doc của Bio-Rad.

1.1 Ðịnh lượng HCV:

Kỹ thuật: Branched DNA: Khếch đại tín hiệu. Test kit: Bayer. Thế hệ 3. Thực hiện trên máy System 340 bDNA Analyzer, Bayer.

1.2 Serotype HCV:

Kỹ thuật: Phản ứng miễn dịch gắn men. Test kit: Murex. Thực hiện trên máy ELISA tự động ETI-STAR, Dia-Sorin.

1.3 Phương pháp nghiên cứu:

Tiền cứu cắt ngang.

III. Kết quả:

1. Thực hiện PCR phát hiện HCVRNA:

Tổng số 1023 trường hợp nhiễm HCV được thực hiện HCVRNA bằng PCR: Kết quả có 728 (71%) trường hợp HCVRNA [+]; 295 (29%) trường hợp HCVRNA [-].

Có 319 trường hợp thực hiện đồng thời anti HCV (Thế hệ 3) và HCVRNA bằng PCR: Kết quả có 223 (70%) trường hợp HCVRNA [+]; 96 (30%) trường hợp HCVRNA [-].

2. Thực hiện serotype HCV:

Bảng 1

3. Khảo sát mối tương quan giữa số lượng HCV và HCV serotype:

Tổng cộng có 169 trường hợp.

Tuổi từ 21 – 71, độ tuổi trung bình là 47,4.

Giới: Nam 87 trường hợp (51.48%), nữ 82 trường hợp (48.52%).

Phân bố số lượng virus theo serotype.

Bảng 2

Khảo sát số lượng virus theo nhóm type & tiên lượng đáp ứng với điều trị đặc hiệu. Bảng 3:

IV. Bàn luận:

1. HCVRNA:

Cho đến nay, xét nghiệm thường qui để chẩn đoán nhiễm HCV là anti HCV. Xét nghiệm này cũng được dùng trong tầm soát ở những người cho máu. Nhờ đó đã hạn chế rất nhiều tỷ lệ nhiễm HCV sau truyền máu. Tuy nhiên, trong một số trường hợp như: Giai đoạn sớm của viêm gan siêu vi C, khi mà chưa có kháng thể; Ở bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch hay do dùng thuốc ức chế miễn dịch; nồng độ anti HCV thấp... sẽ có tình trạng anti HCV âm tính giả. Mặc khác, khi mà bệnh nhân đã nhiễm trong quá khứ thì kháng thể sẽ tồn tại một thời gian dài có khi đến 10 năm dù đã hết bệnh; đồng thời trong một số trường hợp như viêm gan tự miễn sẽ có Anti HCV dương tính giả 6,7,8,11.

Chính vì vậy một khi áp dụng kỹ thuật PCR, một kỹ thuật cực kỳ nhạy & đặc hiệu để tìm HCVRNA là dùng đến một xét nghiệm trực tiếp tìm HCV, nhờ vậy xét nghiệm này tránh được một số trường hợp âm tính hoặc dương giả của Anti HCV 6,7.

Chúng tôi khảo sát 2 nhóm bệnh nhân thực hiện Anti HCV : Một nhóm biết nhiễm HCV( Đã xét nghiệm Anti HCV ở ngoài, không rõ thế hệ test kit), một nhóm được thực hiện Anti HCV thế hệ III tại MEDIC. Bởi vì Anti HCV của thế hệ I, II có độ nhạy & đặc hiệu kém hơn . Kết quả cho thấy không có sự khác biệt rõ rệt giữa 2 nhóm. Như vậy, có thể bệnh nhân đã được thực hiện Anti HCV thế hệ III như tại trung tâm chúng tôi, hoặc đây là các bệnh nhân đã biết chắc nhiễm siêu vi C từ lâu .

Theo kết quả ở 2 nhóm thực hiện HCVRNA, ta thấy chỉ có 71% & 70% trường hợp Anti HCV [+] là có mang HCVRNA, chứng minh là có mang virus dạng hoạt động. Các trường hợp anti HCV [+], HCVRNA [-] có thể do: bệnh nhân đã nhiễm và đã khỏi bệnh, chỉ còn kháng thể tồn tại; HCVRNA rất dao động trong cơ thể nên phải làm lại HCVRNA sau 3 tháng để kiểm tra; Có thể là viêm gan tự miễn và Anti HCV dương giả; HCVRNA âm tính giả do kỹ thuật thực hiện PCR.

2. Serotype HCV:

Kết quả xác định type HCV như trình bày trong bảng 1. Chúng tôi áp dụng kỹ thuật miễn dịch để định type HCV. Ưu điểm của kỹ thuật này là đơn giản, có thể thực hiện ở máy hoàn toàn tự động, rẻ, không sợ nguy cơ ngoại nhiễm. Sử dụng kháng nguyên của vùng NS 4 (Không cấu trúc) 1,16. Tuy nhiên, phương pháp này có một số nhược điểm như: Không định được subtype, chỉ xác định được kháng thể nên không rõ là bệnh nhân còn mang HCVRNA không, ở bệnh nhân bị ức chế miễn dịch hay suy giảm miễn dịch sẽ không có anti HCV và sẽ không xác định được type, không phân biệt được giữa anti HCV nhiễm trước đây còn tồn tại & type HCV đang nhiễm, một số dòng mới làm cho ta không xác định được type... 2,3

Sự phù hợp giữa serotype và genotype vẫn còn nhiều bàn cãi do nhiều công trình công bố kết quả khác nhau 1. Theo tài liệu cung cấp bởi hãng Murex, Murex HCV serotyping định type được 84.7%(221/261) trường hợp, với 93.7%(207/221) trường hợp phù hợp với genotype 16. Theo Matinot & CS: thực hiện serotype HCV 220 trường hợp có 8% không phù hợp với sequencing, độ đặc hiệu là 72%, độ nhạy 78% 1. Tuveri & CS: Độ phù hợp giữa serotype và LiPA chỉ 12/21 ca(57%) ở bệnh nhân HIV[-], và 4/19 (21%) ca có HIV [+]. Nói chung, độ phù hợp giữa serotype với kháng thể từ vùng NS4 và genotype HCV là 65-75%, và 50-60% ở bệnh nhân bị ức chế miễn dịch 1.

Theo kết quả như trình bày trong bảng 1, các serotype chiếm tỷ lệ chủ yếu là type 1 và 6. Với type 1 là type khó đáp ứng với điều trị đặc hiệu, đồng thời cũng chiếm tỷ lệ cao trong các trường hợp tái phát 5,6,9,14 . Type 6 thường chỉ gặp ở vùng Đông Nam Á 3,6 nên khả năng đáp ứng điều trị đặc hiệu chưa có nhiều nghiên cứu. Theo Nguyễn Thanh Hảo & CS, thực hiện trên 123 đối tượng cho máu tình nguyện, tỷ lệ genotype HCV type1: 1a: 15.4%, 1b: 48.8%, 1: 5.6%; 6: 14.6% 4 ; Theo P. Trimoulet & CS thực hiện genotype HCV trên 10 trường hợp: 1a: 10%, 1b : 40%, 6a: 50% 13 . Như vậy, kể cả genotype & serotype đều cho thấy type HCV chủ yếu ở Việt Nam là type 1 & 6. Tuy nhiên chúng ta cần có một nghiên cứu với số lượng lớn hơn mới có thể khẳng định cho điều này. Trong thời gian tới, tại trung tâm chúng tôi sẽ tiến hành áp dụng 2 kỹ thuật : INNOLiPA và Sequencing trong việc định genotype HCV như một kỹ thuật thường qui. Khi đó, chúng ta sẽ có đủ dữ liệu để biết các type HCV của Việt Nam.

3. Số lượng virus HCV trong mỗi type khác nhau:

Số lượng virus & type HCV là 2 yếu tố quan trọng trong việc tiên lượng đáp ứng với điều trị đặc hiệu. Type 1 thường khó đáp ứng với điều trị đặc hiệu.Theo bảng 2 và 3 ta thấy: Số lượng virus ở type 1 và 6 nhiều: Type 1 có 41 trường hợp (65.08%) trên 2x10 6 copies/ml; 10 trường hợp (15.87% ) trên 10 7 copies/ml. Type 6 có 42 trường hợp (56%) trên 2x10 6 copies/ml; 10 trường hợp (13.33%) trên 10 7 copies/ml. Bên cạnh đó, type 2 có 10 trường hợp (55.56%) trên 2x10 6 copies/ml, tuy nhiên do chỉ có 18 trường hợp là type 2 nên khó có thể nói trong type 2 thì luợng virus cao. Điều đặc biệt chúng tôi ghi nhận ở đây là không có trường hợp nào ở type 2 mà lượng virus cao hơn 10 7 copies/ml. Do đó nên thường ở type 2 bệnh nhân đáp ứng cho điều trị đặc hiệu tốt hơn. Ngoài ra, ở 10 trường hợp không xác định được type, lượng virus thường cao: 9 trường hợp (90%) trên 2x10 6 copies/ml, trong đó có 2 trường hợp (20%) trên 10 7 copies/ml. Như vậy các trường hợp không xác định này sẽ khó có đáp ứng tốt với điều trị đặc hiệu, để có thể xác định được type thì phải thực hiện thêm genotype. Đây chính là lý do chúng tôi tiến tới thực hiện INNOLiPA & Sequencing cho định genotype HCV trong chẩn đoán thường qui.

V. Kết luận:

Viêm gan do virus C vẫn còn khó khăn trong chẩn đoán, điều trị đắt tiền mà hiệu quả vẫn còn hạn chế, chưa có thuốc chủng ngừa. Tần suất mang HCVRNA của bệnh nhân anti HCV[+] là 70%. Như vậy các trường hợp anti HCV[+] mà không có HCVRNA chiếm 30% trường hợp. Hai serotype chủ yếu ở nhóm bệnh nhân chúng tôi là 1 & 6; với type 1 có tiên lượng đáp ứng kém với điều trị. Do đó, cần có nghiên cứu với số lượng lớn hơn, áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử như LiPA, sequencing để xác định genotype, từ đó mới có lựa chọn điều trị đặc hiệu tốt nhất cho bệnh nhân nhiễm HCV. Kết quả thực hiện định lượng virus trước& trong khi điều trị sẽ giúp ích rất nhiều cho chúng ta trong việc lựa chọn phương pháp điều trị, chọn thuốc, liều, thời điểm ngưng điều trị.

SUMMARY

TESTS TO DIAGNOSIS VIRAL HEPATITIS C

Hepatitis causing by hepatitis C virus is the dangerous and difficult treatable disease, left the heavy consequences to the patients, and does not have the available vaccin. Therefore, the determination, qualification, as well as typing of HCV are the necessary parameters to meet the requirement of physicians while they select the most propriety regime to treat and follow up the infected patients. In this study, we are have carried out the immunoassay to detect anti HCV and serotype of HCV from patients’sera; performed the molecular biology assay to detect HCV RNA (using RT-PCR tagert the 5’UT region of viral genome), and to quatify the HCV in the patients blood (using bDNA). The received results have demonstrated that 70% HCVRNA[+] among 319 cases with anti HCV[+]. With 169 cases that have been done the serotyping, the most common serotypes detected are type 6 (44,6%) and type 1(37,3%). Type 1 is referred as the most difficult to response to the specific treatment. From the quantification assay, the results have also received that type 1 and type 6 infected patients with high quantity of viremia. From this study, the role of the molecular biology assays are defined as the very necessary laboratory tool to help phycisians in diagnostic as well as treatment of patients with HCV infection.

REFERENCES

• Decker et al. Hepatitis C 1997: Essay and Expert Opinions on its Natural History, Epidermiology, Diagnosis and Therapy. Abbott Diagnostics Division.
• Detmer et al. Accurate Quantification of Hepatitis C Virus (HCV) RNA from All HCV Genotypes by Using Branched- DNA Technology. Journal Of Clinical Microbiology. Vol.34, No 4. Apr. 1996, p 901-907
• DEV et al. Southeast Asian Patients With Chronic Hepatitis C: The Impact of Novel Genotypes and Race on Treatment Outcome. Hepatology, Vol. 36, No 5, 2002.
• Nguyễn Thanh Hảo et al. Genotýp virút viêm gan C ở Việt Nam. Hội nghị chuyên đề bệnh gan mật. Hội gan mật Hà Nội. Tháng 4/2000.
• Hawkins et al. Comparison of Plasma Virus Loads among Individuals Infected with Hepatitis C Virus (HCV) Genotypes 1, 2, and 3 by Quantiplex HCV RNA Assay Versions 1 and 2, Roche Monitor Assay, and an In-House Limiting Dilution Method. Journal Of Clinical Microbiology. Vol. 35, No. 1. Jan. 1997, p 187-192.
• Johannes Bircher et al. Clinical Hepatology. Second Edition. Oxford University Press. 1999. p 858-868, 903-922.
• Judith C. Wilber et al. Serological and Virological Diagnostic Tests for Hepatitis C Virus Infection. Seminars in Gastrointestinal Disease, Vol 6, No 1. January, 1995. p 13-19.
• Lothar Thomas. Clinical Laboratory Diagnostics, Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH- Books. 1999. p 1273-1278.
• NIH Consensus Statement. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: Management of Hepatitis C: 2002-June 10-12, 2002. Hepatology, Vol. 36, No. 5, Suppl. 1. 2002
• Leonard B. Seeff. Natural History of Chronic Hepatitis C. Hepatology, Vol. 36. No. 5. Suppl. 1. 2002.
• Sheila Sherlock & James Dooley. Diseases of the Liver and Biliary System. Elaventh Edition. Blackwell Sciencen Ltd. 2002. p 305-316.
• Thierry Poynard. Hepatitis B and C, Management and Treatment. Mertin Dunitz Ltd. 2002. p 67-136.
• P. Trimoulet, H.J.A. Fleury. Genomic Characterization of Vietnamese HCV Isolates by a Novel Sequencing Mothod. The 50 th Annual Meeting & Postgraduate Courses of The AASLD. November 5-9, 1999, Dallas, Texas USA.
• Yamada et al. Efficacy of Interferon Alfa Therapy in Chronic Hepatitis C Patients Depends Primarily on Hepatitis C Virus RNA Lavel. Hepatology, Vol. 22, No. 5, 1995.
• Wilber J.C. Manual of Clinical Microbiology. 1995. Hepatitis C Virus, p 1050-1055.
• Murex HCV Serotyping 1-6 Assay. Packing Insert. Product Code HC02. 1998.