Home Page | Tài liệu chuyên môn | Bạn cần biết | Thông tin hội nghị | Liên hệ

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI ĐỂ  XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B

Hồ Tấn Đạt, Phạm Thị Thu Thủy,
Nguyễn Bảo Toàn, Nguyễn Thị Kiều Oanh, Nguyễn Thanh Tòng.
Trung Tâm Y Khoa MEDIC, TP. Hồ Chí Minh.

Tóm Tắt

Tám kiểu gen của siêu vi viêm gan B (HBV) đã được xác định (Từ A đến H) dựa vào sự khác nhau trên 8 % của bộ gen HBV, và sự phân bố của các kiểu gen khác nhau ở các châu lục, các nước khác nhau. Việc xác định kiểu gen của HBV ngày càng được quan tâm bởi vì kiểu gen HBV có liên quan đến biểu hiện triệu chứng lâm sàng, diễn tiến của bệnh cũng như đáp ứng với điều trị của viêm gan siêu vi B. Bên cạnh đó, vấn đề phát hiện đột biến kháng thuốc, đặc biệt là các đột biến kháng Lamivudine trong điều trị HBV giữ một vai trò rất quan trọng để từ đó chúng ta mới có lựa chọn thuốc đúng và hiệu quả trong điều trị viêm gan siêu vi B. Chúng tôi ứng dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) trên hệ thống OpenGene với bộ thuốc thử TruGene (Bayer) trong việc xác định kiểu gen và các đột biến kháng thuốc Lamivudine đã được công bố của HBV. Trong thời gian từ tháng 8/2004 đến tháng 5/2006, tại phòng xét nghiệm Trung Tâm Y Khoa MEDIC, chúng tôi thực hiện giải trình tự chuỗi cho 122 trường hợp bệnh nhân Việt Nam viêm gan siêu vi B mãn tính đang điều trị Lamivudine. Nam chiếm 97 trường hợp (79,5%), nữ 25 trường hợp (20,5%), với tuổi trung bình của bệnh nhân 33,9 ± 10,4. Tất cả các trường hợp đều HBVDNA [+], trong đó HBeAg [+] là 100 trường hợp (82,0 %) và HBeAg [-] là 22 trường hợp (18,0 %). Chỉ có 2 kiểu gen của HBV là kiểu gen B và C, trong đó kiểu gen B là 76 trường hợp (62,3 %) và kiểu gen C là 46 trường hợp (37,7 %). Tổng cộng có 78 trường hợp (63,9%) có đột biến kháng Lamivudine, tỷ lệ và các kiểu đột biến như sau: L180M & M204I (11,5%); L180M & M204V (36,1%); L180M, M204V & V173L (0,8%); L180M, M204V & V207I (0,8%); M204I (12,3%); M204I & V207I (0,8%); M204V (1,6%). Trong 76 trường hợp kiểu gen B có 49 trường hợp (64,5%) có đột biến kháng Lamivudine, và 46 trường hợp kiểu gen C có 29 trường hợp (63,0%) có đột biến kháng Lamivudine. Tất cả bệnh nhân đang điều trị Lamivudine với thời gian điều trị trung bình là 2,5 ± 0,9 năm với số trường hợp tương ứng cho điều trị 1, 2, 3, 4 năm là 18, 41, 45, 18 trường hợp. Tỷ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau 1, 2, 3, 4 năm điều trị Lamivudine là 27,8%; 63,4%; 71,1%; 83,3%. Qua kết quả bước đầu đạt được chúng tôi thấy rằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi giữ một vai trò rất quan trọng trong việc xác định kiểu gen siêu vi viêm gan B cũng như việc nhận diện được các đột biến kháng thuốc Lamivudine để từ đó chúng ta có một phác đồ điều trị tối ưu.

Summary

APPLYING SEQUENCING TO IDENTIFY HEPATITIS B VIRUS

GENOTYPES AND MUTATIONS

Hepatitis B Virus (HBV) can be classified into 8 genotypes A through H based on an intergroup divergence of 8% or more in the complete nucleotide sequence, and the different distribution of various genotypes in different continents, countries. The identification of HBV genotypes are more concerned as it is HBV genotypes relating to clinical manifestation, activity of liver disease as well as treatment responses of Hepatitis B. Additionally, the discovery of resistance to medicines in HBV treatment plays a very important role from which we can have an appropriate and effective choice in Hepatitis B treatment.We have applied the Sequencing by OpenGene system with Trugene HBV Genotyping kit (Bayer) to identify Hepatitis B Virus Genotypes and Lamivudine – resistant mutation.
From August 2004 to May 2006, in MEDIC laboratory, we have implemented sequencing for 122 cases Vietnamese with Chronic Hepatitis B on Lamivudine treatment in which: 97 cases are males (take 79.5%) and 25 cases are females (take 20.5%), medium age: 33.9±10.4. All cases are HBVDNA [+] in which: 100 cases are HBeAg [+] (82.0%) and 22 cases are HBeAg [-] (18.0%). There are only two genotypes of HBV: genotype B and genotype C, in which 76 cases are genotypes B (62.3%) and 46 cases are genotype C (37.7%).
Totally there are 78 cases (63.9%) mutations with following established proportion and types: L180M & M204I (11.5%); L180M & M204V (36.1%); L180M, M204V & V173L (0.8%); L180M, M204V & V207I (0.8%); M204I (12.3%); M204I&V207I (0.8%); M204V (1.6%).
There are 49 cases mutations in 76 cases of genotypes B (64.5%) and 29 cases in 46 cases of genotypes C (63.0%). All patients are on Lamivudine treatment with average time is 2.5±0.9 years, the corresponding number of patients in treatment period of 1, 2, 3, 4 year are 18, 41, 45, 18. The proportion of developing mutations after 1, 2, 3, 4 years of treatment with Lamivudine is 27.8%; 63.4%; 71.1%; 83.3%.
We have found that - with above preliminary results - the sequencing plays a very important role in identifying Hepatitis B Virus Genotypes and Mutations. From those results we can approach an optimal treatment course.

I. Đặt vấn đề:

Những tiến bộ mới trong điều trị viêm gan do siêu vi B (HBV) đã góp phần đáng kể trong việc hạn chế những biến chứng của bệnh. Cho đến nay đã có 4 loại thuốc điều trị HBV đã được FDA (Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ) công nhận là Interferone, Lamivudine, Adefovir và Entecavir, trong đó Lamivudine vẫn được xem là thuốc uống được lựa chọn đầu tiên. Tuy nhiên trong quá trình điều trị Lamivudine đã có vấn đề phát sinh: Vấn đề đột biến kháng Lamivudine của HBV, tỉ lệ đột biến kháng này xảy ra ngày càng cao tăng theo thời gian dùng thuốc Lamivudine.
Một vấn đề mới ngày càng được quan tâm là kiểu gen của HBV (HBV Genotype). Khác với kiểu gen siêu vi viêm gan C (HCV) có vai trò quan trọng trong việc đánh giá điều trị đặc hiệu thì vai trò của kiểu gen HBV chưa được rõ ràng lắm. Sự phân bố của kiểu gen HBV thay đổi tùy theo vùng địa dư, mỗi châu lục hay mỗi nước sẽ có các kiểu gen vượt trội khác nhau.
Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử có thể dùng để xác định các đột biến kháng thuốc của HBV cũng như xác định kiểu gen của HBV. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequengcing) để đồng thời vừa xác định các đột biến kháng thuốc Lamivudine của HBV vừa xác định được kiểu gen HBV, khảo sát kiểu gen nào vượt trội ở người Việt Nam cũng như đánh giá các loại và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine theo thời gian điều trị Lamivudine.
Mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) Xác định kiểu gen của HBV ở bệnh nhân Việt Nam; (2) Khảo sát các kiểu đột biến và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine ở bệnh nhân điều trị Lamivudine liên tục.

II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:

1, Đối tượng nghiên cứu:

Bệnh nhân người Việt Nam, đã được chẩn đoán viêm gan siêu vi B mãn tính đang được điều trị liên tục bằng Lamivudine.
Các bệnh nhân được chia làm 4 nhóm với thời gian điều trị liên tục Lamivudine tương ứng là 1, 2, 3, 4 năm.
Có xét nghiệm HBVDNA dương tính.
Không bị đồng nhiễm siêu vi viêm gan C.

2, Kỹ thuật thực hiện:

2.1, Kỹ thuật giải trình tự chuỗi:

Huyết thanh bệnh nhân được tách và lưu trong ống mẫu tinh sạch, nếu mẫu chưa thực hiện ngay thì được lưu ở nhiệt độ – 200C. DNA của HBV được tách chiết theo nguyên tắc hấp thụ trên hạt Silicate (Phương pháp BOOM) rồi rửa bằng Ethanol 70%. Thực hiện phản ứng trùng hợp chuỗi (PCR) trên bộ thuốc thử TruGene HBV Genotyping (Bayer), máy luân nhiệt Bio-Rad theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi kiểm tra có sản phẩm khuếch đại (Amplicons) bằng điện di trên thạch Agarose thì tiếp tục thực hiện phản ứng cắt đoạn (Clip reaction) theo hướng dẫn của nhà sản xuất trên máy luân nhiệt, tiếp tục thực hiện điện di trên thạch Acrylamide với hệ thống OpenGene. Tín hiệu sẽ tự động thu nhận từ hệ thống điện di và phần mềm máy tính sẽ sắp xếp trình tự chuỗi của mẫu, và trình tự chuỗi này sẽ được so sánh với thư viện gen (Gene Librarian) có sẵn được cung cấp bởi nhà sản xuất (Bayer). Kết quả thu nhận được là kiểu gen của HBV và các đột biến kháng Lamivudine đã được công bố.

2.2, HBeAg:

Kỹ thuật thực hiện theo phương pháp điện hóa phát quang, thuốc thử của hãng Abbott, thực hiện trên máy Architect (Abbott).

3, Phương pháp nghiên cứu:

Cắt ngang.

4, Thống kê:

Phần mềm SPSS for Win, Ver. 7.5.

III, Kết quả:

1, Tổng số có 122 trường hợp được thực hiện giải trình tự chuỗi:
Tuổi nhỏ nhất là 10, lớn nhất là 63 với độ tuổi trung bình là 33,9 ± 10,4.
Nam có 97 trường hợp chiếm 79,5% và nữ có 25 trường hợp chiếm 20,5%.
2, Kiểu gen của HBV trong 122 trường hợp:
Chỉ có 2 kiểu gen của HBV được xác định là kiểu gen B và C. Trong đó kiểu gen B là 76 trường hợp (62,3%) và kiểu gen C là 46 trường hợp (37,7%).
3, Kết quả HBeAg:
Tất cả 122 trường hợp đều có HBVDNA dương tính, trong đó HBeAg âm tính là 22 trường hợp (18%) và HBeAg dương tính là 100 trường hợp (82%). Kết quả của HBeAg trong các kiểu gen khác nhau cũng được ghi nhận.
Bảng 1. Tỉ lệ HBeAg và các kiểu gen B, C.

4, Kiểu gen HBV và các đột biến kháng Lamivudine:
Bảng 2. Tỉ lệ của đột biến kháng Lamivudine và kiểu gen HBV.

5, Các kiểu đột biến kháng Lamivudine và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine theo thời gian điều trị:
Tổng cộng có 78 (63,9%) trường hợp có đột biến kháng Lamivudine.
Bảng 3. Tỷ lệ các loại đột biến kháng Lamivudine và tỉ lệ phần trăm.

Ghi chú: L (Leucine); M (Methionine); I (Isoleucine); V (Valine).

Có 4 nhóm bệnh nhân được khảo sát dựa trên thời gian điều trị Lamivudine, số lượng bệnh nhân sau 1, 2, 3, 4 năm điều trị Lamivudine tương ứng là 18, 41, 45, 18 trường hợp. Thời gian điều trị Lamivudine trung bình là 2,5 ± 0,9 năm.
Bảng 4. Tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine và thời gian điều trị Lamivudine.

IV, Bàn luận:

1, Kiểu gen HBV:

Có 2 cách phân loại HBV: Kiểu huyết thanh (Serotype) và kiểu gen (Genotype). Trước đây người ta phân HBV thành 4 kiểu huyết thanh adr, adw, ayr và ayw dựa vào các kháng nguyên của kháng nguyên bề mặt HBV (HBsAg). Tuy nhiên những ý nghĩa của kiểu huyết thanh chưa được nghiên cứu nhiều. Với sự phát triển của sinh học phân tử, ngày nay người ta phân loại HBV dựa vào nghiên cứu trên bộ gen của HBV và phân HBV thành 8 loại đặt tên từ A đến H dựa vào sự khác nhau trên 8% của toàn bộ bộ gen của HBV. Có nhiều kỹ thuật dùng để xác định kiểu gen HBV như kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing), sự đa hình của các đoạn cắt giới hạn (RFLP), phản ứng lai các đoạn dò (LiPA), phản ứng trùng hợp chuỗi với các đoạn mồi đặc hiệu (PCR with Specific Primers), phản ứng miễn dịch gắn men (Enzyme-linked immunoassay)…Kỹ thuật chúng tôi dùng để xác định kiểu gen của HBV là kỹ thuật giải trình tự chuỗi vì bên cạnh việc xác định được kiểu gen của HBV chúng tôi còn tìm được các đột biến kháng Lamivudine chỉ trong một lần thực hiện giải trình tự chuỗi.
Vai trò của kiểu gen HBV chưa được nghiên cứu nhiều cũng như có nhiều nghiên cứu với số liệu nhỏ, rãi rác công bố với kết quả không phù hợp nhau, điều này khác với vai trò của kiểu gen HCV trong vấn đề điều trị viêm gan siêu vi C.
Kiểu gen của HBV phân bố ở các châu lục và vùng lãnh thổ khác nhau thì khác nhau. Kiểu gen HBV chủ yếu ở Đông Nam Á là kiểu gen B và C, điều này cũng phù hợp với kết quả của chúng tôi với 122 trường hợp thực hiện giải trình tự chuỗi có 76 trường hợp (62,3%) kiểu gen B và 46 trường hợp (37,7%) kiểu gen C. Trong 122 trường hợp thực hiện giải trình tự chuỗi (HBV DNA dương tính) chúng tôi ghi nhận trong đó HBeAg âm tính là 22 trường hợp (18%) và HBeAg dương tính là 100 trường hợp (82%). Có vài nghiên cứu đã được công bố cho thấy đối với kiểu gen B của HBV có thải trừ HBeAg cao hơn so với kiểu gen C. Tuy nhiên kết quả của chúng tôi (Bảng 1) không có sự khác biệt rõ rệt giữa tỉ lệ HBeAg âm tính ở kiểu gen B và C (15,8% và 21,7%). Vai trò của kiểu gen HBV trong diễn tiến của bệnh viêm gan siêu vi B cũng được nghiên cứu, kết quả cho thấy kiểu gen C dường như làm cho rối loạn chức năng gan nhiều hơn kiểu gen B cũng như kiểu gen C dễ diễn tiến đến xơ gan nhiều hơn kiểu gen B. Mối liên hệ giữa kiểu gen HBV và ung thư tế bào gan cũng được ghi nhận: Kiểu gen B thường kết hợp với sự phát triển ung thư tế bào gan ở người trẻ tuổi, một nghiên cứu khác lại cho thấy kiểu gen C thường kết hợp với ung thư tế bào gan và có tỉ lệ tái phát ung thư tế bào gan cao hơn sau khi được phẫu thuật cắt bỏ ung thư tế bào gan so với kiểu gen B. Anh hưởng của kiểu gen HBV với đáp ứng điều trị Lamivudine cũng chưa được nghiên cứu nhiều, một nghiên cứu cho thấy dường như bệnh nhân kiểu gen B dễ phát triển đột biến kháng Lamivudine hơn các kiểu gen khác. Kết quả của chúng tôi ghi nhận (Bảng 2) tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine ở kiểu gen B (64,5%) và kiểu gen C (63%) là gần bằng nhau. Do đó các vấn đề về ảnh hưởng của kiểu gen HBV cần phải được nghiên cứu lâu dài và số lượng bệnh nhân nhiều hơn.

2, Các kiểu và tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine ở bệnh nhân điều trị Lamivudine:

Lamivudine là thuốc uống được lựa chọn đầu tiên trong điều trị viêm gan siêu vi B mãn tính vì có nhiều ưu điểm như giá thành có thể chấp nhận được, an toàn, ít tác dụng phụ, dễ sử dụng (Dùng đường uống), tuy nhiên có một nhược điểm mà ngày càng được nhiều người quan tâm là vấn đề đột biến kháng Lamivudine của siêu vi viêm gan B và tỉ lệ đột biến kháng thuốc Lamivudine tăng theo thời gian sử dụng Lamivudine.
Vị trí đột biến kháng Lamivudine xảy ra trên vùng C (Domain C) của đoạn gen sao chép ngược (RT: Reverse Transcriptase) của HBV chủ yếu là kiểu YMDD (tyrosine-methionine-aspartate-aspartate), ở đó Methionine sẽ được thay bằng Valine, Isoleucine và hiếm khi là Serine (Đột biến rtM204V/I/S). Những đột biến khác cũng liên quan đến kháng Lamivudine như đột biến thay Leucine thành Methionine ở vùng B (Domain B) là đột biến rtL180M; Đột biến V173L; Đột biến V207I. Trong 122 trường hợp giải trình tự chuỗi thì có 78 trường hợp (63,9%) có đột biến kháng Lamivudine. Có nhiều kiểu đột biến kháng Lamivudine, chủ yếu là đột biến ở vị trí 204 và có kèm hoặc không các đột biến rtL180M, V173L, V207I. Kết quả của chúng tôi cho thấy có rất nhiều dạng của đột biến kháng Lamivudine (Bảng 3) trong đó chiếm nhiều nhất là đột biến rtL180M và M204V (36,1%).
Lamivudine được dùng điều trị viêm gan siêu vi B thường với thời gian điều trị kéo dài, tối thiểu phải là 1 năm. Nhiều nghiên cứu đã công bố cho thấy tỉ lệ xuất hiện đột biến kháng Lamivudine của HBV lại tăng dần theo thời gian điều trị Lamivudine. Theo Guan R. và cộng sự, tỉ lệ xuất hiện đột biến kháng Lamivudine sau 1 năm điều trị Lamivudine là 14%, và tỉ lệ này tăng dần theo thời gian điều trị Lamivudine là 38%, 49%, 66% và 69% tương ứng với thời gian điều trị Lamivudine là 2, 3, 4, và 5 năm. Một nghiên cứu khác của T-T Chang và cộng sự cũng đã cho thấy tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine sau một năm điều trị Lamivudine là 17%, và tăng dần theo thời gian điều trị Lamivudine 2, 3, 4 năm tương ứng là 40%, 57%, 67%. Kết quả khảo sát tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine trong 4 nhóm bệnh nhân có điều trị liên tục Lamivudine với 4 nhóm thời gian điều trị khác nhau (Bảng 4) của chúng tôi cũng cho thấy tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau 1 năm điều trị Lamivudine là 27,8%, và tỉ lệ này cũng tăng dần theo các nhóm có thời gian điều trị Lamivudine tăng dần là 2, 3, 4 năm là 63,4%, 71,1% và 83,3%. So sánh với các công trình đã công bố chúng ta có thể thấy rằng tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau một thời gian điều trị bằng Lamivudine ở nghiên cứu của chúng tôi cao hơn. Có rất nhiều nguyên nhân ảnh hưởng đến việc xuất hiện đột biến kháng Lamivudine trong quá trình điều trị, tuy nhiên có một yếu tố quan trọng có thể làm cho tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine cao là vấn đề sử dụng thuốc Lamivudine có đúng theo hướng dẫn bác sĩ điều trị không, điều trị Lamivudine thành nhiều đợt khác nhau trước khi bệnh nhân được đưa vào nhóm nghiên cứu. Kết quả này cho chúng ta thấy một tỉ lệ khá cao của đột biến kháng Lamivudine, và việc phát hiện đột biến kháng Lamivudine kịp thời giữ một vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình điều trị viêm gan siêu vi B bằng Lamivudine để từ đó chúng ta có thể thay đổi thuốc điều trị thích hợp nhằm đạt được mục tiêu điều trị.

V, Kết luận:

Kiểu gen HBV ở Việt Nam chủ yếu là B và C, tuy nhiên vai trò của kiểu gen HBV trong diễn tiến bệnh cũng như đáp ứng điều trị chưa được biết rõ. Các kiểu đột biến kháng Lamivudine của nhóm bệnh nhân chúng tôi thì đa dạng, đặc biệt tỉ lệ đột biến kháng thuốc Lamivudine cao và tăng dần theo thời gian dùng thuốc Lamivudine. Qua kết quả bước đầu đạt được chúng tôi thấy rằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi giữ một vai trò rất quan trọng và có thể được áp dụng như một xét nghiệm thường qui trong việc xác định kiểu gen siêu vi viêm gan B cũng như việc nhận diện được các đột biến kháng thuốc Lamivudine để từ đó chúng ta có một phác đồ điều trị tối ưu.

REFERENCE.

1. Anna S. K. Lok and Brian J. McMahon. Chronic Hepatitis B: Update of Recommendations. Hepatology, Vol 39, No. 3, 2004.
2. Bernhard Zollner. Viral features of Lamivudine resistant Hepatitis B genotypes A and D. Hepatology Volume 39, Jan 2004, Issue 1, p. 42-50.
3. B. Zollner et Al. Prevalence, Incidence, and Clinical relevance of the reverse transcriptase V207I mutation outside the YMDD motif of the Hepatitis B Virus polymesase during Lamivudine therapy. Journal of Clinical Microbiology, May 2005, p. 2503-2505, Vol. 43, No. 5.
4. Chi-Jen Chu and Anna S. K. Lok. Clinical significance of Hepatitis B Virus Genotypes. Hepatology, Vol. 35, No. 5, 2002.
5. Chi-Jen Chu et Al. Hepatitis B Virus genotype B is associated with earlier HBeAg seroconversion compared with Hepatitis B Virus genotype C. Gastroenterology. June 2002. Volume 122, Number 7.
6. Emmet B. Keeffe et Al. A treatment Algorithm for the Management of chronic Hepatitis B Virus infection in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. Vol. 2, No. 2. February 2004.
7. Entecavir ( Baraclude): An Overview. www.HIVandHepatitis.com.
8. Erwin Sablon and Fred Shapiro. Hepatitis B and C genotyping: methodologies and implications for patient management. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 2004. 19. S329-S337.
9. Erwin Sablon et Al. Early detection of Hepatitis B Drug Resistance: Implications for Patient Management. Expert Rev. Mol. Diagn. 535-547. 2003. www.future-drugs.com.
10. FDA Approves New treatment for chronic Hepatitis B. FDA Tall Paper. www.fda.gov.com.
11. Hajime Sumi et Al. . Influence of Hepatitis B Virus Genotypes on The Progression of Chronic Type B Liver Disease. Hepatology, Vol. 37, No. 1, 2003.
12. Harald H. Kessler. Detection of Mutations in the Hepatitis B Virus Polymerase Gene. Clinical Chemistry. 2003. 49. No. 6. p 989-992.
13. Hideo Naito et Al. Rapid and Specific Genotyping System for Hepatitis B Virus corresponding to six Major Genotypes by PCR using Type-Specific Primers. Journal of Clinical Microbiology, January 2001, p. 362-364, Vol. 39, No. 1.
14. Huy Thien-Tuan Tran et Al. Recombination of genotypes B and C in Hepatitis B Virus isolated from a Vietnamese patient with fulminant Hepatitis. Journal of Infection Disease. 56, p. 35-37. 2003.
15. Jin-de Chen et Al. Hepatitis B genotypes correlate with tumor recurrence after curative resection of HepatoCellular Carcinoma. Clinical Gastroenterology and Hepatology. January 2004. Vol. 2. Number 1.
16. Man-Fung Yuen et Al. Significance of Hepatitis B Genotype in Acute exacerbation, HBeAg seroconversion, Cirrhosis-related complications, and HepatoCellular Carcinoma. Hepatology, Vol. 37, No. 3, 2003.
17. Marion G. Peters et Al. Adefovir difivoxilefovir Dipivoxil Alone or in Combination with Lamivudine in Patients with Lamivudine-Resistant Chronic Hepatitis B. Gastroenterology Vol. 126, No. 1, January 2004.
18. Morris Sherman et Al. The Management of Chronic Viral Hepatitis: A Canadian Consensus Conference 2004. Canadian J. Gastroenterol. Vol. 18, No. 12. December 2004. p. 715-728.
19. Scott K. Fung et Anna SF Lok. Management of Hepatitis B Patients with Antiviral Resistance. Antiviral Therapy 9: 1013-1026. International Medical Press. 2004.
20. Stephen Locarnini. Hepatitis B Viral Resistance: Mechanisms and Diagnosis. Victorian Infectious Diseases Reference Laboratory, Victoria, Australia.
21. Stephen Locarnini et Al. Management of Antiviral of Antiviral Resistance in Patients with Chronic Hepatitis B. Antiviral Therapy 9: 679-693. International Medical Press. 2004.
22. Ting-Tsung Chang et Al. Four years of Lamivudine Treatment in Chinese Patients with Chronic Hepatitis B. Journal of Gastroenterology and Hepatology 19, p. 1276-1282. 2004.
23. Toumy Guettouche and H. J. Hnatyszyn. Chronic Hepatitis B and viral genotype: The clinical significance of determining HBV genotypes. Antiviral Therapy 10: 593 – 604. 2005.
24. William E. Delaney et Al. The Hepatitis B Virus Polymerase mutation rtV173L is selected during Lamivudine therapy and Enhances viral replication in vitro. Journal of Virology, Vol. 77, No. 21, p. 11833-11841. Nov. 2003.